来源：药闻窗

基因编辑有望治愈先天性疾病

随着人类基因组测序的完成、高效基因编辑技术的出现，针对基因水平的准疾病治疗逐渐走入大众的视野。基因编辑主要指利用基因工程手段对核酸序列DNA或RNA进行修饰，从而实现靶基因的定向改变，如基因插入、删除和置换等，最终获得所需要的新性状。

基因编辑治疗为解决困扰人类已久的先天疾病带来希望。由于许多先天疾病是由遗传基因异常导致的，因此长久以来，人类无法根治这一类型的疾病。基因编辑可以深入病源，带来治愈的希望。

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基因编辑给先天性疾病带来希望

基因是决定生物表征的重要因素。一般将基因宽泛理解为存储生物遗传信息的载体。基因的存在使生物能够保留优势表征，是高级生物出现的基础。但是基因的遗传也伴随着大量的不确定性，不确定性来自于生物活动的随机性，不确定性带来了进化的可能性，同时也带来了疾病风险。对于大部分有性繁殖生物来说，基因一半来自父亲一半来自母亲，因此后代可能因为基因的纯合或杂合导致父辈中未曾出现过的疾病。

在人类以往的历史中，基因疾病往往难以治愈。由于基因深藏于人类身体最深处，难以从源头解决问题，通常需要长期服药以控制疾病进展，疾病负担较重。同时，许多基因疾病属于罕见病，治疗方案十分有限，导致较高的药物价格和较低的可及性，属于未被满足的医疗需求。

随着基因编辑工具的不断进步，基因编辑疗法也进入了发展的快车道。TALEN、ZFN，以及几乎革新了整个基因编辑领域的CRISPR-Cas系统使基因编辑疗法变得触手可及。2020年，来自加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna教授和普朗克研究所的Emmanuelle Charpentier因在CRISPR领域的突出贡献获得了诺贝尔化学奖。与此同时，J. Doudna教授作为共同创始人成立的Intellia Therapeutics，E. Charpentier作为共同创始人成立的CRISPR Therapeutics已成长为基因编辑治疗领域的领军者，两家公司均已有管线进入临床阶段，有望在不久的未来，为困扰人类已久的基因疾病治疗带来曙光。同时，基于基因编辑技术，方兴未艾的细胞治疗也有望迎来跨越式的发展。

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DNA缺陷伴随一生且可能影响后代

DNA通过蛋白控制影响着身体的活动和表征。DNA转化为蛋白质的过程分为两大步，第一步：DNA转化为mRNA，这一步骤称为转录（transcription），发生在细胞核内；第二步：mRNA 转化为蛋白质，这一步骤称为转译（translation），发生在细胞质中。mRNA是DNA转化为蛋白质的中间体，这也是它名称的由来，即信使RNA（messenger RNA）。

通俗来讲，DNA类似于底稿，DNA发生的改变会一直存在于体内，由此细胞分裂新产生的细胞也会继承这些改变，因此DNA的改变有很大概率会伴随一生，其中性细胞中DNA的变化甚至能够遗传至下一代。同时部分DNA片段会影响mRNA产生的速率与表达量。mRNA类似于说明书，能够指导自身细胞生产出特定的蛋白。蛋白则是最终生产得到的工具，对生物个体的各项指标直接产生作用。mRNA或蛋白的变化不会被继承或遗传。这一条转录转译链被称为生物学“中心法则”（The Central Dogma）。

图1  中心法则：DNA-mRNA-蛋白转化过程

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DNA与基因疾病和遗传性疾病

根据美国国家癌症研究院的定义，遗传遗传性疾病（hereditary syndrome）通常指部分或完全由具有遗传性的基因或染色体异常导致的疾病。根据美国国家人类基因研究院的定义，基因疾病（genetic disorder）指完全或部分由于DNA序列异常导致的疾病。遗传性疾病和基因疾病虽然不完全相同，但包含了很多重叠的病症。

DNA作为人类遗传物质的存储载体，深藏在细胞核中。一方面受到细胞结构和人体免疫机制的层层保护，不易发生改变；但另一方面，在出现基因异常时，现有的医学技术也难以提供有效的治疗方案。同时，DNA异常通常会伴随患者一生，且有很大几率遗传至后代。因此，患者疾病负担大，且缺乏有效的治疗手段。

除此之外，许多罕见病是由基因缺陷造成的。大部分具有缺陷的基因，会导致基因的携带者难以生存。由于基因是遗传信息载体，因此在长时间的自然选择中，这类基因难以被继承，所以许多基因疾病/遗传疾病都属于未被满足的医疗需求。

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基因编辑的作用原理

基因编辑工具使人类拥有了定向改变DNA 或RNA 的能力。通过插入、删除、替代特定位点的核苷酸，我们能够改变基因表达，进而长久地影响蛋白序列或结构。援引发表在Yale Journal of Biology and Medicine 上的文章“Genome Editing: Past, Present, and Future”的内容，历史上，人类不断探索能够改变基因的方式。在20 世纪时，人类曾通过化学疗法、放射疗法改变肿瘤细胞的DNA，扰乱肿瘤细胞的生命活动，以此消灭肿瘤。但这2 种方法造成的基因变化是随机的，且难以精准定位。随着科学技术的发展，科学家们发明了3 种重要的基因编辑工具：锌指（ZFN）、TALEN、CRISPR。现代基因编辑工具的出现不仅大大加速了科学研究，同时也给许多基因疾病的治疗带来的可能性。

精准定位是基因编辑的重要能力，是实现定向编辑的第一步。靶向特定目标序列，而不是在DNA任意位置随意更改，使基因编辑成为可控的工具，并且规避不受控的基因突变带来的风险。不受控制的基因突变或不够精准的基因修改，常常会带来无法预测的肿瘤、免疫疾病等恶性病症。

在精确定位的基础上，一个好的基因编辑工具还应该能够识别并定位到任意的设定序列。这样基因编辑才能够广泛应用于不同的基因疾病。

许多基因疾病是由DNA 的错误表达或过度表达引起的。通过基因敲除或抑制，便能达到较好的治疗效果。因此，仅仅依靠基因编辑工具进行定位，同时引入可控的酶在这一位点进行切割，便能大大缓解乃至治愈这类疾病。目前，大部分体内基因编辑疗法便是利用这一机理，对致病基因进行定向敲除，达到治疗目的。

随着生物技术的发展，科学家们已经开始了基因敲入的研发。相较于基因敲除，基因敲入更为复杂，往往需要基因编辑工具以及基因插入技术（例如病毒载体插入技术）共同完成，因此目前的进展落后于基因敲除疗法。但基因敲入带来了更多治愈疾病的可能性，尤其对于部分由基因过少或缺失表达引起的疾病。

05
基因编辑具有永久有效的潜力

虽然名称相似，但基因编辑（gene editing）与基因治疗（gene therapy）有着本质的不同。

基因编辑，通过对基因进行改造，纠正错误的基因。由于这一改变发生在原本的基因组中，因此，就算细胞发生了分裂，这一改变也会被继承。因此，基因编辑通常被认为具有永久纠正致病基因的潜力。更进一步，若这一改变发生在性细胞中，则这一改变将可能被后代继承。

基因治疗，则是通过递送额外的基因进入细胞，使得细胞能够额外表达上述基因，但并不改变此前已经存在的基因。新的基因也不会被整合进入原本的基因组中，因此，在细胞发生分裂后，这一改变也不会被继承。理论上来讲，相较于基因编辑，基因治疗的持久性稍差。

图2  基因治疗 vs. 基因编辑治疗

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基因编辑工具：CRISPR

人类对生物医药的探索不断，所掌握的药物种类不断丰富。从小分子化学药到生物药、核酸干扰药物（RNAi）、基因治疗、基因编辑治疗。随着药物种类的丰富，治疗能够触达的靶点也更为广阔：小分子化学药和生物药（单抗、双抗等）作用于蛋白质，RNAi 作用于RNA，基因治疗和基因编辑作用于DNA。

图3  药物迭代史

TALEN，Transcription Activation-Like Effector Nucleases，是一种限制性酶。通过工程化改造后，具有切割DNA链特定位点的能力。TALEN主要分为2个功能域：DNA结合域（DNA binding domain）和DNA切割域（DNA cleavage domain）。

DNA结合域负责识别位点，引导切割酶至正确的编辑位点。DNA结合域的核心部分由相连的数个重复的氨基酸序列片段组（tandem amino acid repeats）组成，每个氨基酸片段组由33-34个单位的氨基酸构成，每个片段组对应DNA链上的1个碱基。每个氨基酸片段组的序列基本相同，除了第12-13个氨基酸不同，这两个位点被称为repeat-variable diresidue（RVD）。正因为这2个位置的氨基酸可变，因此通过控制这两个位置的氨基酸，基因编辑工具可以靶向DNA的4种不同碱基。每个片段组对应1个DNA碱基，数个前后衔接的片段组便可以靶向特定的DNA序列。

图4  TAL Effector结构

图5  TAL Effector中一个repeat单位的蛋白三维结构示意图

DNA切割域在DNA结合域的帮助下，来到选定的位点进行切割。FokI内切酶是常见的切割工具。FokI 需要形成二倍体（dimer）来进行切割，因此TALEN通常由2条分别靶向DNA正链和反链的TALEN组成。TALEN将会切割2个靶向序列之间的位置。

图6  TAL Effector + FokI 二倍体

优势：

相较于ZFN，TALEN 靶向性更强，毒性较小（可能由于更准确的亲和导致）。

相较于ZFN，TALEN 不需要选择或定向进化，节省构造时间和成本。

相较于CRISPR，TALEN 不需要PAM 序列，理论上可选择的靶点更多。（但由于基因组中通常有多个潜在有效靶点，因此这一优势并不突出）。

劣势：

TALEN 结构较大，对递送提出了较高的要求。常见的病毒载体慢病毒（lentivirus）和腺相关病毒（AAV）难以运送这么大分子量的“货物”。目前科学家尝试以mRNA 的方式递送TALEN。

相较于CRISPR，TALEN 的制造流程相对复杂，成本较高。

相较于CRISPR，TALEN 的结构设计更为复杂。CRISPR 仅需重新构建gRNA 序列即可，而TALEN 需要考虑DNA 结合等因素。

CRISPR，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，来源于细菌和其他微生物。

CRISPR 是细菌对抗病毒入侵的重要免疫机制，通过识别病毒基因序列，CRISPR 可以引导细菌内的生物机制对病毒基因序列进行摧毁和消灭，使病毒无法在细菌体内复制繁殖。

CRISPR是细菌基因组内的一片由短小DNA重复片段（回文）和spacer组成的区域。当某一种类病毒首次入侵时，病毒的部分基因片段会被整合存储在spacer中。经过转录（transcription）和各类蛋白的处理，带有病毒基因序列的CRISPR RNA（crRNA）形成，并引导分子切割机制对病毒基因进行切割。由于序列直接由病毒基因复制得到，因此crRNA与病毒基因的识别匹配程度非常高。

图7  CRISPR 对抗病毒入侵机制

CRISPR机制赋予了一个可靠的定位机制。在此基础上，一个完整的基因编辑工具还需要切割机制来对DNA 链进行切割。自然界中， 细菌的CRISPR免疫系统中包含的Cas家族基因（CRISPR-associated gene）便可以完成这一工作。Cas家族中包含多个不同的基因，拥有不同的功能或切割方式。

gRNA负责是CRISPR基因编辑的定位器。gRNA由crRNA和tracrRNA组成。crRNA携带有目标序列的RNA。crRNA和tracrRNA形成互补结构，科学家进一步研究发现，将crRNA和tracrRNA相连，并不影响整体机制的运作和活性。形成的单链gRNA（sgRNA）更为便捷。

Cas蛋白是负责切割DNA链的剪刀。Cas蛋白中，HNH域负责切割靶序列，RuvC域负责切割靶序列的互补链。切割位点与PAM序列相关。

此前CRISPR无法在哺乳动物细胞中发挥作用，原因是CRISPR-Cas系统无法穿过核膜进入细胞核。张锋团队在Cas 蛋白序列上添加了NLS（Nuclear localization sequence），NLS与入核载体相互作用，将Cas运载进入细胞核。

优势：

易于操作，简单便捷。

设计空间大，基本可以靶向任何靶点序列。

成本较低。

gRNA和Cas可以拆分递送。

劣势：

CRISPR的gRNA长度有限制，可能导致脱靶事件出现。

07
基因编辑治疗路径

基因编辑治疗根据基因编辑发生的场景主要分为2 条路径：体内（in vivo）和体外（ex vivo）。

图8  基因编辑治疗的2 条路径

体内基因编辑指将基因编辑工具递送进入患者体内，基因编辑发生在人体内。而顾名思义，体外基因编辑治疗中，基因编辑发生在体外（例如实验室等），通常需要提取患者细胞，在实验室中对患者细胞进行基因编辑，再将经工程化改造后的细胞回输至患者体内。整体流程类似于现有的CART细胞治疗。

两条路径各有优势，也各有不同的技术挑战。目前来看，采用体外基因编辑路径的公司相对更多。

这一选择可能是由于体内基因编辑对安全性的要求更高、技术难度更大。

体内基因编辑相较于体外基因编辑难度更高，而体内基因编辑中，基因敲入比基因敲除难度更高。因此，基因敲入所需掌握的技术复杂，要求高。因此目前进展也落后于其他路径。

从步骤上来看，基因敲除通过CRISPR系统gRNA和Cas在特定位点剪切DNA链，造成双链断裂（DSB），使靶点基因无法正常表达。根据Intellia的设计思路，基因敲入同样需要CRISPR系统先剪切DNA双链，再通过病毒载体（Intellia目前使用的是腺相关病毒AAV作为载体）在剪切位置插入缺失的基因。

因此基因敲入由2个部分组成。第一部分由LNP作为递送系统包裹用于定位的gRNA和编码Cas（用于切割）的mRNA，在设定位点进行切割。第二部分由病毒载体作为递送系统，将患者缺失的基因递送进入细胞核，并整合进患者基因中。

图9  体内基因编辑-敲入治疗实现路径

相较于体内编辑，体外基因编辑是竞争者较多的细分赛道。主要原因是体外基因编辑可以通过质量控制保证基因编辑的质量，将不达标的细胞去除，从安全性的角度来看更为可靠，也更容易被监管机构所接受。

从某个角度来说，体外基因编辑是利用基因编辑工具赋能细胞治疗。目前的细胞治疗，受制于细胞免疫机制，以自体型为主。排异反应来自多个人体免疫机制，例如T 细胞和NK 细胞（与HLA 基因相关）。同时，若输注的治疗细胞量较大的话，输注细胞可能会对人体细胞产生排异（与TCR 相关）（GvHD）。通过基因编辑，尽量干扰或阻断引起排异反应的信号通路。

Intellia 在此提供了一些可能的改进思路。例如：通过敲除治疗细胞的TCR 来避免移植物排斥宿主病（GvHD）；通过基因敲入引入CAR 或TCR 来增强细胞对肿瘤的杀伤；敲除II 型HLA 基因来避免CD-4 介导的排异反应；敲除HLA-A 来避免CD-8 介导的排异反应；调整HLA-B 和HLA-C 来避免NK 细胞介导的排异反应。